Skip to content

instytut dermatologii zacisze kraków opinie

2 miesiące ago

409 words

Po szybkim rozmrażaniu komórki płukano PBS, utrwalano 4% paraformaldehydem i permeabilizowano 0,1% Triton / PBS. Komórki zablokowano 1% BSA i inkubowano z przeciwciałami przeciwko TCR. (sc-9100) i TCR. (sc-5277) (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Komórki przemyto i inkubowano z anty-króliczymi Alexa Fluor 488 i anty-mysimi koniugatami Alexa Fluor 546 (Invitrogen). Po płukaniu komórki umieszczono przy użyciu antygenu ProLong Gold i zbadano za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu mikroskopu konfokalnego Leica SP2. Komórki HeLa hodowano na szkiełkach nakrywkowych w 24-studzienkowych płytkach i transfekowano (Ig konstruktów plazmidowego DNA (pCMV-HA, pCMV-HA.TRAC.WT, pCMV-HA.TRAC.MUT, wektor pEGFP i pEGFP.TRBC1. WT) przy użyciu Lipofectamine 2000 (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. Po 24 godzinach komórki przemyto PBS, utrwalono w 4% paraformaldehydzie i permeabilizowano. Subkomórkową dystrybucję HA.TRAC oceniano przez inkubację komórek z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi przeciw HA (Sigma-Aldrich), wykrywano stosując koniugat Alexa Fluor 546 (Invitrogen), a jądra barwiono stosując jodek TO-PRO-3 (Invitrogen). Na koniec, komórki zamontowano przy użyciu Citifluor (Citifluor Ltd.), a obrazy wizualizowano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Leica SP2. Immunoblot. Kontrolne i PBMC pacjenta i komórki RPMI 8866 poddano lizie przez 10 minut na lodzie w buforze do lizy (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM chlorek sodu, 1% Triton-X 100, 5 mM EDTA; inhibitory proteazy Halt [Pierce] ) przed wyjaśnieniem na 13 000 g. Lizaty zmniejszono (5 minut w 70 ° C, bufor próbki LDS i środek redukujący [lnvitrogen]) i alkilowano (10 minut w temperaturze pokojowej, 50 mM jodoacetamid) i poddawano elektroforezie przy 25 mA / żel na podwójnych 10% żelach SDS poliakrylamidowych. Białka przenoszono na membranę PVDF przy 30 mA / żel przez 120 minut. Po zablokowaniu przez godzinę w 5% mleku w TBS-0,5% Tween-20 (TBST), membrany pocięto i sondowano 0,4 .g / ml anty-TCR. (H-142, Santa Cruz Biotechnology Inc.), anty-TCR. (G-11, Santa Cruz Biotechnology Inc.) lub anty-aktyna (AC-74, Sigma-Aldrich) przez noc w 4 ° C w 5% mleku w TBST. Po 4 płukaniach po 5 minut każdy w TBST, bloty inkubowano z odpowiednim drugorzędowym przeciwciałem (10. 20 ng / ml koziej anty-mysiej HRP lub 20 ng / ml kozim anty-króliczym HRP) przez godzinę. Bloty przemywano jeszcze 4 razy przed inkubacją z substratem chemiluminescencyjnym (West Dura, Pierce) i ekspozycją na film. Podziękowania Dziękujemy obydwu rodzinom i naszym współpracownikom klinicznym i laboratoryjnym za pomoc. Jesteśmy wdzięczni P. Gissenowi za pomocną radę. Wsparcie finansowe zapewnili WellChild, Wellcome Trust i Birmingham Children s Hospital Research Foundation. WP Tate jest wspierane przez Radę Badań Zdrowia Nowej Zelandii i fundusz Marsden. Przypisy Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J Clin Invest. 2011; 121 (2): 695. 702. doi: 10,1172 / JCI41931.
[hasła pokrewne: schizofrenia hebefreniczna, hematolog kielce, rak szyjki macicy leczenie ]

0 thoughts on “instytut dermatologii zacisze kraków opinie”